Kỹ thuật PCR (Phần 2)

BioMedia

Xem bài: Kỹ thuật PCR (Phần 1) tại đây

Các loại kỹ thuật PCR

Allele-specific PCR: một kỹ thuật chẩn đoán hay nhân bản dựa trên biến đổi đơn nucleotide (SNVs không nên nhầm lẫn với SNPs) (đây là những khác biệt ở bazo đơn lẻ trong một bệnh nhân). Nó yêu cầu thông tin về một trình tự ADN, trong đó có sự khác biệt giữa các alen, thường sử dụng các đoạn mồi nucleotide biến đổi ở đầu 3′ của trình tự. Quá trình khuếch đại cần điều kiện rất nghiêm ngặt nên sẽ ít hiệu quả khi mồi và khuôn không bổ sung hoàn toàn.

Assembly PCR or Polymerase Cycling Assembly (PCA): là quá trình tổng hợp nhân tạo các trình tự ADN dài bằng việc thực hiện phản ứng PCR trên một nhóm oligonucleotide dài với các phân đoạn ngắn gối lên nhau. Các oligonucleotide xen kẽ theo hướng sense và antisense, và các phân đoạn gối nhau này xác định trật tự của các đoạn PCR, từ đó chọn lọc tổng hợp các sản phẩm ADN dài cuối cùng.

Asymmetric PCR: ưu tiên khuếch đại một sợi ADN trong một phân tử ADN sợi kép. Nó được sử dụng trong giải trình tự và lai đầu dò khi mà chỉ một trong hai sợi bổ sung cần được khuếch đại. Phản ứng PCR tiến hành như bình thường, nhưng sử dụng lượng mồi lớn cho các sợi ADN đích cần khuếch đại. Bởi vì sự khuếch đại sẽ bị chậm ở giai đoạn sau của phản ứng khi lượng mồi đã sử dụng hết nên phản ứng PCR cần có thêm chu kỳ phụ. Gần đây, một sự biến đổi về quá trình này, được gọi là Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR), sử dụng lượng mồi giới hạn với một nhiệt độ nóng chảy cao (Tm) so với lượng mồi dư thừa nhằm duy trì hiệu quả phản ứng cũng như nồng độ mồi giới hạn giảm đi ở giữa các phản ứng.

Dial-out PCR: một phương pháp PCR song song giúp nhanh chóng tìm các phân tử ADN chính xác để tổng hợp gen. Một thư viện phức tạp của các phân tử ADN được biến đổi với vùng hai bên đặc thù phía trước trình tự song song. Mồi Tag-directed sau đó sẽ có khả năng tìm kiếm các phân tử với các trình tự mong muốn bằng PCR.

Digital PCR (dPCR): được sử dụng để định lượng số lượng của một sợi ADN đích trong một mẫu ADN. Các mẫu ADN được pha rất loãng để sau khi chạy nhiều phản ứng PCR song song một số trong các phản ứng đó không nhận được một phân tử ADN đích. Nồng độ ADN đích được tính toán bằng cách sử dụng tỷ lệ các kết quả âm tính.

Khuếch đại phụ thuộc helicase: tương tự như kỹ thuật PCR truyền thống, nhưng sử dụng nhiệt độ ổn định hơn thông qua các giai đoạn biến tính và gắn mồi/ kéo dài của chu kỳ. ADN helicase là enzyme tháo xoắn ADN, được sử dụng thay thế cho việc biến tính bằng nhiệt.

Hot start PCR: kỹ thuật làm giảm sự khuếch đại không đặc hiệu trong quá trình PCR. Nó có thể được thực hiện bằng cách gia nhiệt các thành phần phản ứng ở nhiệt độ biến tính (ví dụ, 95°C) trước khi thêm các polymerase. Hoạt động của polymerase bị ức chế bởi enzyme đặc hiệu, hoặc kháng thể hoặc bởi sự hiện diện của các liên kết cộng hóa trị với chất ức chế có khả năng phân ly khi được kích hoạt ở nhiệt độ cao.

In silico PCR (digital PCR, virtual PCR, electronic PCR, e-PCR) các công cụ tính toán được sử dụng để tính toán trên lý thuyết kết quả phản ứng chuỗi polymerase, sử dụng một tập hợp các đoạn mồi (đầu dò) để khuếch đại chuỗi ADN từ một trình tự của gen hoặc hệ phiên mã.

Intersequence-specific PCR (ISSR): một phương pháp PCR in dấu vân tay ADN, nó khuếch đại các vùng giữa trình tự đơn lặp đi lặp lại để tạo ra một dấu vân tay duy nhất của độ dài đoạn khuếch đại.

Inverse PCR: thường được sử dụng để xác định các trình tự hai bên xung quanh vị trí chèn gen. Nó bao gồm một loạt các trình tự phân hủy ADN và tự nối lại, kết quả là trình tự đã biết nằm ở hai đầu của trình tự chưa biết.

Ligation-mediated PCR: sử dụng các trình tự ADN nhỏ gắn với ADN mà chúng ta cần quan tâm và dùng nhiều mồi gắn với các trình tự liên kết ADN; nó được sử dụng để xác định trình tự ADN, thăm dò hệ gen, và làm dấu chuẩn ADN.

Methylation-specific PCR (MSP): được phát triển bởi Stephen Baylin và Jim Herman tại trường Y Johns Hopkins và được sử dụng để phát hiện methyl hóa các đảo CpG trong ADN của bộ gen. ADN được xử lý với sodium bisulfit, chuyển cytosine không bị methyl thành uracil, và gắn với thymine trong phản ứng PCR. Hai phản ứng PCR sau đó được thực hiện với các ADN bị biến đổi, sử dụng cặp mồi giống nhau ngoại trừ vị trí đảo CpG trong trình tự mồi. Tại những điểm này, một cặp mồi bổ sung với cytosines để khuếch đại ADN bị methyl hóa, và một cặp mồi bổ sung với uracil hay thymine để khuếch đại ADN không bị methyl hóa. MSP sử dụng qPCR cũng có thể được thực hiện để xác định thông tin về số lượng hơn là chất lượng ADN bị methyl hóa.

Miniprimer PCR: Sử dụng một polymerase chịu nhiệt (S – TBR) có thể kéo dài từ đoạn mồi ngắn “smalligos” khoảng 9 hoặc 10 nucleotide. Phương pháp này cho phép phản ứng PCR nhắm đến các mồi liên kết với các vùng có kích thước nhỏ hơn, và được sử dụng để khuếch đại trình tự ADN bảo thủ, như gen rRNA 16S (hay 18S ở sinh vật nhân thực).

Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA): cho phép khuếch đại đa mục tiêu với một cặp mồi duy nhất, như vậy tránh được giới hạn về độ phân giải của PCR đa mồi.

Multiplex-PCR: bao gồm nhiều cặp mồi trong một hỗn hợp PCR duy nhất để tạo ra bản sao kích thước khác nhau đặc trưng cho các trình tự ADN khác nhau. Với nhiều gen đích được khuếch đại cùng một lúc, nhiều thông tin thu được từ một lần chạy mà không đòi hỏi nhiều hóa chất và thời gian thực hiện. Nhiệt độ gắn mồi phải được tối ưu hóa cho từng cặp mồi để chúng có thể thực hiện chính xác trong một phản ứng đơn, với nhiều kích thước khuếch đại khác nhau. Như vậy chiều dài các cặp bazo phải khác nhau để tạo ra các băng có thể phân biệt bằng mắt thường khi điện di.

Nanoparticle-Assisted PCR (nanoPCR): Trong những năm gần đây, một số báo cáo cho rằng các hạt nano (NP) có thể nâng cao hiệu quả của phản ứng PCR (do đó được gọi là nanoPCR), thậm chí còn tốt hơn so với những chất tăng cường phản ứng PCR trước đó. Người ta cũng đã tìm thấy rằng các chấm lượng tử (QDs) có thể cải thiện độ đặc hiệu và hiệu quả của phản ứng PCR. Ống nano cacbon một vách (SWCNTs) và ống nano cacbon đa vách (MWCNTs) tăng cường sự khuếch đại trong các phản ứng PCR dài. Nanopowder Carbon (CN) được báo cáo rằng có thể nâng cao hiệu quả của phản ứng PCR lặp và PCR dài. Hạt nano ZnO, TiO2, và Ag cũng đã được tìm ra để tăng hiệu suất phản ứng PCR. Điều quan trọng là, các dữ liệu trước đây chỉ ra rằng, các hạt nano phi kim loại vẫn đảm bảo tính xác thực của phản ứng khuếch đại trong giới hạn cho phép. Sử dụng nhiều hạt nano có khả năng cải tiến hiệu suất PCR, rõ ràng rằng chúng có tiềm năng lớn để cải tiến công nghệ nanoPCR và phát triển sản phẩm.

Nguồn ảnh: http://pubs.rsc.org/

Nested PCR: PCR lồng làm tăng độ đặc hiệu của phản ứng PCR bằng cách giảm độ nhiễu do sự khuếch đại ADN không đặc hiệu. Sử dụng hai cặp mồi trong hai phản ứng PCR liên tiếp. Trong phản ứng đầu tiên, một cặp mồi được sử dụng để tạo ra các sản phẩm ADN, bên cạnh đoạn ADN đích mà phản ứng hướng đến vẫn có thể bao gồm các đoạn ADN khuếch đại không đặc hiệu. Các sản phẩm sau đó được sử dụng tiếp phản ứng PCR thứ hai với cặp mồi mà vị trí gắn khác hoàn toàn hoặc khác một phần từ vị trí 3′ của mỗi mồi ở phản ứng đầu tiên. PCR lồng thường thành công hơn phản ứng PCR thông thường đặc biệt trong trường hợp khuếch đại các đoạn ADN dài, nhưng nó cũng đòi hỏi thông tin chi tiết hơn về các trình tự đích.

Overlap-extension PCR or Splicing by overlap extension (SOEing): một kỹ thuật kỹ thuật di truyền được sử dụng để ghép nối hai hoặc nhiều phân đoạn ADN có chứa các trình tự bổ sung với nhau. Nó được sử dụng để nối những đoạn ADN chứa gen , trình tự điều hòa, hoặc đột biến; kỹ thuật này cho phép tạo ra các ADN cấu trúc đặc trưng và dài. Nó cũng có thể thêm vào các đột biến mất, thêm hay đột biến điểm để tạo thành một trình tự ADN khác.

PAN-AC: sử dụng điều kiện đẳng nhiệt để khuếch đại ADN, và có thể được sử dụng trong các tế bào sống.

Quantitative PCR (qPCR): PCR định lượng được sử dụng để đo số lượng của một trình tự đích (thường trong thời gian thực). Nó đo hàm lượng ban đầu của ADN , ADNc , hoặc ARN. PCR định lượng thường được sử dụng để xác định xem sự có mặt của trình tự ADN trong mẫu và số lượng bản sao của nó trong mẫu là bao nhiêu. PCR định lượng có độ chính xác cao. Phương pháp PCR định lượng sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang, chẳng hạn như Sybr Green, EvaGreen hoặc đầu dò ADN chứa huỳnh quang, như TaqMan, để đo số lượng sản phẩm khuếch đại trong thời gian thực. Đôi khi, nó cũng được viết tắt là RT – PCR (real – time PCR) nhưng chữ viết tắt này chỉ nên được sử dụng cho PCR phiên mã ngược. qPCR thường được viết tắt cho PCR định lượng.

Reverse Transcription PCR (RT-PCR): PCR phiên mã ngược dùng để khuếch đại ADN từ ARN. Enzyme phiên mã ngược sao mã ngược ARN tạo thành ADNc, sau đó ADNc này được khuếch đại bằng PCR. RT – PCR được sử dụng rộng rãi trong biểu hiện gene, để xác định sự biểu hiện của một gen hoặc để xác định trình tự của một bản sao mã ARN, bao gồm cả vùng khởi đầu và kết thúc phiên mã. Nếu đã biết trình tự ADN một gen, RT – PCR có thể được sử dụng để lập bản đồ vị trí của exon và intron trong gen. Đầu 5′ của một gen (tương ứng với vị trí khởi đầu phiên mã) thường được xác định bởi RACE – PCR (Rapid Amplification of ADNc Ends).

Solid Phase PCR: bao gồm rất nhiều nghĩa, trong đó có Polony Amplification (nơi các cụm PCR được tìm thấy trên bản gel là một ví dụ), PCR cầu (cặp mồi được liên kết cộng hóa trị với một bề mặt rắn có chức năng hỗ trợ). Gồm Solid Phase PCR thường và Solid Phase PCR tăng cường.

Suicide PCR: được sử dụng trong nhiều nghiên cứu, điển hình là trong lĩnh vực“paleogenetics” để tránh các kết quả dương tính giả và đảm bảo sự đặc hiệu của trình tự đích cần khuếch đại. Kĩ thuật này bắt nguồn từ một nghiên cứu xác định lại sự tồn tại của vi khuẩn Yersinia pestis trong các mẫu răng thu được từ phần mộ của các nạn nhân bị chết trong đại dịch “cái chết đen” (Black Death) thế kỉ 14. Vào thời điểm đó, phương pháp này cho phép sử dụng duy nhất một lần với bất kì cặp mồi nào trong phản ứng PCR mà những cặp mồi này hoàn toàn chưa được sử dụng trong phản ứng PCR đóng vai trò đối chứng dương trước đó. Hơn thế nữa, những cặp mồi này khuếch đại từ hệ gen các trình tự đích chưa bao giờ được sử dụng trong các nghiên cứu trước. Các điều kiện trên đảm bảo cho không có sự nhiễm từ các phản ứng PCR trước đây được tiến hành trong phạm vi cùng phòng thí nghiệm, nói cách khác để hạn chế kết quả dương tính giả.

Thermal asymmetric interlaced PCR (TAIL-PCR): được sử dụng để phân lập các trình tự chưa biết nằm cạnh một trình từ đã biết. TAIL-PCR sử dụng các mồi đặc hiệu bắt cặp với vùng trình tự đã biết, khuếch đại từ một phía và một mồi suy biến để khuyếch đại từ phía còn lại của trình tự chưa biết.

Touchdown PCR (Step-down PCR): là phản ứng PCR được cải biến để làm giảm các khuếch đại không đặc hiệu bằng cách giảm dần nhiệt độ gắn mồi trong quy trình phản ứng PCR. Nhiệt độ gắn mồi trong các chu kì đầu tiên thường cao hơn từ 3–5°C so với Tm của cặp mồi, trong khi đến các chu kì sau, nhiệt độ gắn mồi thấp hơn 3–5°C so với Tm. Nhiệt độ gắn mồi cao giúp tăng tính đặc hiệu trong quá trình bắt cặp mồi và nhiệt độ gắn mồi thấp hơn cho phép tăng tính hiệu quả trong khuếch đại các sản phẩm đặc hiệu đã hình thành trong chu kì trước.

Universal Fast Walking: Thăm dò hệ gen và dấu vân tay di truyền bằng cách sử dụng PCR ‘hai chiều’ đặc hiệu so với phương pháp tiếp cận ‘một chiều’ thông thường (chỉ sử dụng một mồi đặc trưng cho gen cụ thể và một mồi chung- mà có thể dẫn đến hiện tượng nhiễu giả). Các ứng dụng phù hợp của phương pháp này là LaNe RAGE (lariat-dependent nested PCR for rapid amplification of genomic DNA ends), 5’RACE LANE và 3’RACE Lane.