Hotline 247
04 6662 6362
 
Hà Nội
0968 378 899
 
Hồ Chí Minh
01289 777 888

Sắc ký khí ghép nối khối phổ (Phần 2)

BioMedia

Sắc ký khí: >>> Sắc ký khí

Phổ khối lượng >>>Phương pháp khối phổ (MS)

ICP-MS: Khái niệm, Cấu tạo, Ưu điểm và Ứng dụng

         Sắc ký khí ghép nối khối phổ (Phần 1)

tandem_scheme

  1. Bộ phân tích khối lượng

Các đầu dò chọn lọc khối được chia thành hai nhóm.

– Nhóm 1: tương ứng với các bộ phân tích quét. Loại này bao gồm các bộ phân tích theo cung từ hình quạt, ví dụ như sự chệch hướng từ trường của một tiêu điểm hoặc tiêu điểm kép (khi máy phân tích tĩnh điện được thêm vào). Bộ phân tích cung từ trường là máy phân tích khối lượng đầu tiên được sử dụng nhưng trong các hệ thống GC-MS, các máy phân tích tứ cực mới được sử dụng phổ biến nhất.

– Nhóm 2: bao gồm các bộ phân tích truyền dẫn ion đồng thời. Loại này gồm: bộ phân tích thời gian bay (TOF), các loại bẫy ion (IT) khác nhau và các bộ phân tích khối lượng sử dụng phép biến đổi Fourier (FTMS), đặc biệt là hệ thống quang phổ khối lượng cộng hưởng ioncyclotron (ICR-MS) – các ion được đưa vào vòng quay cyclotron, cyclotron được đặt trong môi trường siêu dẫn (0oK – được làm lạnh bằng Heli lỏng), hiện nay được dùng phổ biến trong các kỹ thuật ghép nối với cả sắc ký khí (GCMS) và sắc ký lỏng (LCMS) bởi độ phân dải và độ nhạy cao.

Các bộ dò chọn lọc khối lượng được phân biệt nhờ các đặc tính kỹ thuật cũng như phạm vi phân tích của chúng, các thông số quan trọng bao gồm: (1) độ phân giải, (2) khối lượng tối đa có thể đo được và (3) độ truyền dẫn ion.

Bộ phân tích khối lượng phân giải thấp (Bộ phân tích theo cung từ, tứ cực, bẫy ion, TOF tuyến tính) thường đo các khối lượng đến số nguyên, không phân biệt được các đồng vị. Trong khi đó bộ phân tích khối lượng phân giải cao có thể xác định chính xác khối lượng (4 – 6 số sau dấu phẩy) và từ đó có thể xác định và phân biệt được thành phần nguyên tố và đồng vị.

Một ví dụ đơn giản nhất: CO+, N2+ và C2H4+ không phát hiện được đồng vị với bộ phân tích phân giải thấp nhưng lại phát hiện được với bộ phân tích phân giải cao.

Độ truyền dẫn ion ở bộ phân tích khối lượng là tỷ lệ giữa các ion được hình thành trong buồng ion hóa và các ion sau khi đi qua bộ phân tích đến được đầu dò.

  1. Hệ thống Phân tích khối phổ liên tiếp – Tandem mass spectrometry

Thông thường, nhiễu hóa học thường thấy trong dòng ion được chiết tách từ các mẫu sinh học, thực phẩm, đất, dẫn đến không có được tính đặc hiệu mong muốn để phát hiện và xác định các chất phân tích một cách đáng tin cậy khi phân tích một hỗn hợp phức tạp với nhiều nhiễu hoặc tạp chất.

Tỉ lệ tín hiệu/nhiễu (S/N) thường tăng cùng với số lượng các bước trong quy trình phân tích. Trong phân tích công cụ, có thể thấy rõ trong hệ thống phân tích kết nối liên tiếp, như GC-MS hay LC-MS, (gồm cả sắc ký đa chiều hay kết nối liên tiếp MS/MS). Cũng giống như việc làm sạch chất chiết được để làm tăng tỉ lệ S/N trong quá trình phân tích công cụ cuối cùng, một máy khối phổ kết nối liên tục bao gồm nhiều bước lọc trong qui trình hoạt động của nó.

Cấu tạo cơ bản của một máy phân tích khối phổ liên tiếp là sự kết nối một chuỗi gồm bộ phân tích khối thứ nhất MS1, buồng kích hoạt va chạm và bộ phân tích khối thứ hai MS2, sau đó là một đầu dò phát hiện và đo các dòng ion.

Các hệ thống phân tích khối phổ liên tiếp được chia thành hai nhóm lớn tùy theo kiểu của bộ phân tích khối lượng.

– Nhóm 1: gồm các bộ phân tích khối phổ liên tiếp theo thời gian (tandem-in-time) như các bẫy ion tuyến tính và tứ cực, bẫy ion theo quỹ đạo (orbitrap) và FT-ICR-MS: các ion được tạo thành trong vùng ion hóa được bẫy lại, phân lập và phân mảnh sau đó được phân tách theo tỷ lệ khối lượng/điện tích m/z. Các quá trình này xảy ra trong cùng bộ phân tích khối lượng nhưng nối tiếp nhau, do đó các ion thu được có thể xem là thế hệ con, cháu… của ion hình thành ban đầu (MSn).

– Nhóm hai: gồm các bộ phân tích khối phổ liên tiếp theo không gian (tandem-in-space), trong đó, ít nhất có hai bộ phân tích khối lượng được tách biệt nhau theo không gian. Các hệ thống này nghiên cứu được không chỉ các ion sản phẩm mà còn nghiên cứu được các ion cha mẹ, phản ứng (truyền dẫn) giữa hai ion liên quan tới nhau hay theo dõi được sự biến mất của một phân mảnh trung hòa. Loại ba tứ cực nằm trong nhóm này (ký hiệu QQQ hoặc QqQ).

tandem_mass_spec_2

– Các hệ thống MS/MS lai ghép là sự kết hợp giữa các bộ phân tích có bản chất và nguyên tắc vận hành khác nhau, chẳng hạn kết hợp tứ cực (Q) hay bẫy ion (IT) với bộ phân tích cung từ hình quạt (B) hoặc kết nối với bộ phân tích tĩnh điện (E) hoặc bộ phân tích thời gian bay (TOF), đem tạo thành các thiết bị phân tích khối phổ liên tiếp lai ghép khác nhau như EBE, EBEB, B-QI-Q2, QEB, Q-TOF, IT-TOF-TOFB, EB-TOF-TOF EBE, QBE, …. Sự kết hợp một vài máy phân tích làm tăng đáng kể giá thành của thiết bị cũng như tính phức tạp của việc vận hành chúng nhưng đồng thời cũng làm tăng số lượng và chất lượng thông tin phân tích thu được, độ tin cậy và độ đặc hiệu.

Các thiết bị MS/MS tandem có 2 giai đoạn phân tích khối lượng được tách biệt bởi một phản ứng phân ly (kích hoạt hay tạo ra) của các ion. Phản ứng này xảy ở giai đoạn trước và sau quá trình phân mảnh các ion lựa chọn từ giai đoạn đầu tiên. Việc phân mảnh xảy ra do sự va chạm của các ion lựa chọn với các phân tử khí trơ (He, Ar, Xe or N2, ở áp suất 0,1-0,3 Pa), và do thế gia tốc của trường tĩnh điện đặt vào buồng kích thích va chạm. Khi sử dụng các phương pháp ion hóa nhẹ nhàng (ví dụ như ion hóa hóa học, Cl) hoặc khi ghép nối sắc ký lỏng với khối phổ có nguồn ion hóa phụn điện tử (ESI) hoặc ion hóa hóa học áp suất khí quyển (APCI), các ion phân tử thực tế không phân mảnh và điều này dẫn đến việc thiếu thông tin cần thiết để phân tích cấu trúc phân tử.

Sử dụng một hệ thống phát hiện với nhiều hơn một bộ phân tích khối lượng như bộ ba tức cực phù hợp để phân tích các hợp chất mục tiêu ở mức độ vết (mức nồng độ ppt– ppb) trong các nền mẫu phức tạp, với sự có mặt của các chất gây nhiễu (trong các mẫu thực phẩm, dịch sinh học, mô động thực vật, đất, nước thải và các mẫu môi trường khác).

Kỹ thuật MS/MS rất hữu ích và là một kỹ thuật phân tích tăng cường có giá trị, cần thiết trong các trường hợp mà

(1) tín hiệu nhiễu hóa học cao trong phổ cần đo ở chế độ SIM,

(2) các ion đặc trưng cùng tách ra với các tạp chất đồng vị,

(3) cấu trúc của hợp chất chưa được biết và cần có thêm thông tin về cấu trúc,

(4) phân mảnh đồ thu được ở chế độ SIM cần có thêm thông tin xác nhận và cuối cùng,

(5) cần có độ nhạy và độ đặc hiệu cao khi phân tích (dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, phụ gia xăng dầu, thuốc kích thích trong thể thao – doping …).

Thiết bị có cấu tạo bộ ba tứ cực cho phép thực hiện rất nhiều các thí nghiệm phân tích cũng như các chế độ thu nhận tín hiệu ion, từ đó cung cấp được nhiều thông tin đặc hiệu. Chính vì vậy bài viết này sau đây sẽ mô tả về các chế độ thu nhận tín hiệu dòng ion trong thiết bị ba tứ cực QQQ.

3.1. Chế độ Quét toàn dải

Đây là chế độ thu nhận ion truyền thống, tương tự với chế độ được thực hiện trong các máy quang phổ với bộ phân tích tứ cực đơn (bộ lọc khối). Bộ phân tích khối lượng thứ nhất (MS1) thực hiện quét toàn bộ và ghi lại phổ khối của tất cả các chất phân tích xuất hiện từ cột GC hay LC sau khi được ion hóa và phân mảnh thành các ion phân tử và các ion tạo thành khác. Trong kỹ thuật GC-MS, mẫu với khối lượng 0,05-1ng cũng đủ để thu được phổ khối đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng. Bộ tứ cực trung gian (Q2) và bộ phân tích khối lượng thứ hai (MS2) chỉ hoạt động ở chế độ truyền dẫn ion.

3.2. Chế độ khảo sát ion được lựa chọn SIM

Chế độ thu nhận ion này cũng được nhiều người biết đến và được sử dụng rộng trãi trong các máy phân tích khối phổ tứ cực đơn. Trong trường hợp này, bộ phân tích khối lượng thứ nhất (MS1) chỉ cho một vài ion được chọn đi qua (thường là 3), các ion này thể hiện các đặc tính của chất phân tích đích (target). Hai bộ tứ cực còn lại chỉ truyền dẫn các ion đã được MS1 lọc. Sơ đồ phân mảnh khối lượng được xây dựng dựa trên các phần dòng ion được ghi lại.

Vì mỗi ion được chọn được đo trong một thời gian dài hơn, khoảng 50 ms thay vì 50µs nên nhiễu hóa học được giảm xuống (S/N tăng lên), đạt được các mức độ phát hiện thấp (hệ số 10-100) và điều này cho phép phát hiện chất phân tích mục tiêu ở mức pg hoặc thấp hơn.

Chế độ SIM được sử dụng phổ biến để đo cả hợp chất quan tâm trong một hỗn hợp phức tạp để định lượng độ nhạy, cũng như ghi lại các nhóm hợp chất đồng đồng đẳng bằng cách khảo sát các ion đặc trưng của chúng, cụ thể là đối với n-paraffins: m/z 57, 71, 85, đối với axit béo methyl ester: ion ở m/z 74; đối với alkylbenzene: m/z 91, 105, và đối với phthalate: m/z 149, 167 trong số các chất phân tích khác.

3.3. Chế độ quét ion sản phẩm (ion con)

Ở chế độ thu nhận ion này, một ion tiền thân hay ion cha mẹ được chọn lựa trong bộ phân tích khối lượng hay bộ lọc (MS1) thứ nhất, hoạt động ở chế độ SIM. Ion cha mẹ được lựa chọn (m+) đi qua MS1 và được dẫn đến buồng va chạm. Bộ tứ cực Q2 (q) chỉ hoạt động với tần số radio được thiết đặt (chế độ RF), cho phép truyền dẫn các ion từ bộ phân tích khối lượng thứ nhất tới bộ phân tích khối lượng thứ hai MS2. Khí đưa vào buồng va chạm (thường là He, Ar hay N2), va chạm với các ion được lựa chọn cung cấp thêm năng lượng cho các ion (quá trình kích thích ion); thế được đặt trong Q2 (q) cho phép gia tốc các ion và chuyển một phần động năng của chúng thành nội năng bổ sung (năng lượng quay, dao động và điện). Nội năng của các ion tăng lên dẫn tới sự phân ly của chúng và tạo ra các ion phân mảnh (ion sản phẩm) khác nhau mà sau đó được dẫn tới bộ phân tích khối lượng hay bộ lọc khối lượng thứ hai (MS2). Bộ phân tích này quét trong phạm vi khối lượng nhỏ hơn khối lượng của ion cha mẹ được lựa chọn m+ vì các ion sản phẩm (ion con) rõ ràng phải nhẹ hơn các ion mẹ của chúng.

Chế độ này được biết đến nhiều nhất trong hệ thống ba tứ cực, có thể được sử dụng trong phân tích các hỗn hợp hay các chấp phức tạp có tạp chất mà không cần tách trước trong cột sắc ký.

Nếu phương pháp ion hóa nhẹ nhàng (mềm) được sử dụng, chẳng hạn ion hóa học ion dương, hỗn hợp các chất được ion hóa trong nguồn ion sẽ tạo ra các ion phân tử được thêm một proton (MH+). Bộ phân tích khối lượng thứ nhất (MS1) chọn lọc từng ion phân tử được thêm một proton, những ion này được dẫn tới buồng kích thích va chạm (q), ở đây chúng phân ly; các ion phân mảnh được hình thành từ mỗi MH+ tiếp tục được phân tách bằng bộ phân tích MS2 (Q3) và phổ được ghi lại. Trong trường hợp này, bộ phân tích thứ nhất (Q1) hoạt động như một “cột sắc ký”, bộ tứ cực thứ hai (q) hoạt động như một “buồng ion hóa” và máy phân tích MS2 (Q3) làm nhiệm vụ của bộ phân tích khối lượng và thực hiện xong quá trình quét toàn bộ ion.

Như vậy, chế độ này sẽ tiết kiệm được thời gian bằng cách không sử dụng cột sắc ký và chủ yếu hệ thống QqQ được dùng để tìm kiếm các hợp chất mong muốn có trong một hỗn hợp phức tạp mà không cần tách sắc ký trước đó.

3.3.4. Chế độ quét ion cha mẹ

Chế độ hoạt động này được sử dụng để tìm trong phổ khối những ion (tiền thân – cha mẹ) có thể tạo ra một phân mảnh nhất định (ion sản phẩm). Trong trường hợp này, bộ tứ cực đầu tiên (MS1) hoạt động ở chế độ quét toàn dải (full scan), trong khi bộ tứ cực thứ 3 (MS2) hoạt động ở chế độ khảo sát ion được chọn lọc (SIM). Ion được chọn lọc này là ion sản phẩm (ion con) mà ion cha mẹ của nó đang đươc tìm kiếm.

Về mặt kỹ thuật, qui trình diễn ra như sau: trong bộ phân tích MS2 (Q3), chỉ có những ion sản phẩm – ion con với khối lượng nhất định được lọc ra, trong khi đó bộ phân tích đầu tiên MS1, cho phép tất cả các ion có khối lượng lớn hơn ion con được chọn lọc đi qua. Những ion này đi qua buồng kích hoạt va chạm (q) mà ở đó chúng được phân mảnh, trong đó có tạo ra các ion con đang quan tâm. MS2 hoạt động ở chế độ SIM là bộ lọc tiếp theo, ở đó chỉ những ion con cần quan tâm mới được phép đi qua.

Một ví dụ cụ thể: phân tích một phức hợp gồm 30-40 thành phần, mong muốn phát hiện các phthalate (chất làm dẻo). Ion phổ biến, được phán đoán cho nhóm hợp chất này, được ghi nhận tại đỉnh m/z 149. Sau đó, tất cả các ion có tỉ lệ khối lượng/điện tích m/z cao hơn 149 đi qua bộ phân tích khối lượng thứ nhất MS1 – hoạt động ở chế độ quét toàn dải; trong buồng va cham, các ion này bị phân mảnh từ các ion bố mẹ – phthalate, sau đó được đưa đến bộ phân tích MS2 hoạt động ở chế độ SIM, chỉ lọc các ion có m/z 149. Sơ đồ phân mảnh khối lượng cuối cùng được ghi lại chỉ có các đỉnh sắc ký tương ứng với các phthalate, chính vì vậy, hệ thống phân tích khối lượng 3 tứ cực QqQ hoạt động ở chế độ quét ion tiền thân trở thành một máy phân tích sắc ký có tính chọn lọc.

3.3.5. Chế độ quét các phân mảnh trung hòa không đổi bị biến mất

Ở chế độ vận hành QqQ này, cả hai bộ phân tích khối lượng MS1 và MS2, hoạt động đồng thời ở chế độ quét. Các khối lượng được quét ở cả 2 bộ phân tích tương ứng với các ion có độ sai khác nhất định, bằng khối lượng của phân mảnh trung hòa được lựa chọn.

Nếu ion thế hệ f1, f2, f3, f4, v.v. đi qua bộ phân tích thứ nhất (MS1), và sau đó đi qua buồng kích hoạt va chạm (Q2) thì chúng sẽ phân mảnh. Các sản phẩm phân mảnh có khả năng đi tới bộ phân tích thứ 2 (MS2), tại đây chỉ những ion có độ chênh lệch khối lượng nhất định đã được thiết lập trước đó (f1-Δm, f2-Δm, f3-Δm, f4-Δm, v.v.) mới được đi qua.

Chẳng hạn, nếu thiết lập chế độ quét liên kết giữa hai bộ phân tích tương ứng với độ chênh lệch về khối lượng là 28 đơn vị, thì các ion có m/z 80, 81, và 82 sau khi đi qua bộ phân tích đầu tiên MS1 khi đến bộ phân tích thứ 2 MS2 sẽ chỉ cho phép các ion có m/z 52, 53 và 54 đi qua.

3.3.6. Chế độ khảo sát đa phản ứng MRM

Đây là một trong những phương pháp thu nhận ion của hệ thống ba tứ cực thú vị nhất vì nó cho phép khai thác sử dụng hợp lý các ưu điểm của phương pháp, để biến nó trở thành một đầu dò khối lượng cho GC (hay LC) có tính đặc hiệu, độ chọn lọc và độ nhạy cao. Tuy nhiên, khi thu nhận các ion ở chế độ SIM thì xác suất mà ion được chọn lọc và tín hiệu nền (nhiễu hóa học) thực sự khớp không phải bằng không. Khả năng không thể bỏ qua này của các kết quả dương giả hoặc âm giả, làm giảm độ tin cậy của phương pháp thu dòng ion ở chế độ SIM.

Để tránh các vấn đề này, thay vì khảo sát các ion đặc trưng thì thí nghiệm MRM tập trung hơn vào việc ghi lại các truyền dẫn (hay phản ứng truyền dẫn) giữa các cặp ion (ion tiền thân/ion cha mẹ và ion sản phẩm/ion con cháu).

2045-8118-10-21-3-l

Các ion cha mẹ (F1) được lựa chọn được lọc trong bộ phân tích thứ nhất (MS1 ở chế độ SIM), trong khi chỉ có các ion F2, sản phẩm của phản ứng phân truyền dẫn hay phân ly F1 → F2 được phép đi qua bộ phân tích thứ hai (MS2 hoạt động ở chế độ SIM). Cả hai ion phải ổn định và nói chung phải có nhiều trong phổ khối của chất phân tích. Khảo sát phản ứng của các ion cha mẹ và ion con gần như hoàn toàn loại bỏ xác suất sự trùng lặp của tín hiệu phân tích với tín hiệu nền và nâng cao giá trị S/N. Tiêu biểu là, việc ghi lại hai phản ứng truyền dẫn độc lập cùng với khả năng lưu trong kỹ thuật sắc ký có thể xác nhận rõ ràng sự có mặt của chất phân tích mục tiêu trong hỗn hợp phức tạp.

Việc sử dụng bộ ba tứ cực hoạt động ở chế độ MRM đặc biệt quan trọng đối với việc phân tích các hợp chất (các chất phân tích mục tiêu) ở mức độ vết trong các mẫu nền phức tạp, độ nhiễm tạp cao, có nhiều chất gây nhiễu; (như phân tích dư lượng thuốc trừ sâu trong thực phẩm, thực vật hoặc các mẫu sinh học hay môi trường). Một ứng dụng quan trọng khác là phân tích các chất đánh dấu sinh học trong dầu mỏ.

Nguồn: Book “Advances in Gas Chromatography”, book edited by Xinghua Guo, ISBN 978-953-51-1227-3, Published: February 26, 2014, Chapter 1

Tác giả: Elena Stashenko và Jairo René Martínez

Tổng hợp và dịch: BioMedia Việt Nam

Các bài viết cùng chủ đề

Sắc ký khí ghép nối khối phổ (Phần 2)

Sắc ký khí: >>> Sắc ký khí Phổ khối lượng >>>Phương pháp khối phổ (MS) ICP-MS: Khái niệm, Cấu tạo, Ưu điểm và Ứng dụng          Sắc...