Hotline 247
04 6662 6362
 
Hà Nội
0968 378 899
 
Hồ Chí Minh
01289 777 888

Sắc ký: Hướng dẫn chọn mua cột sắc ký lỏng HPLC (phần 2)

BioMedia

Xem thêm >>> Hướng dẫn chọn mua cột sắc ký lỏng HPLC Phần 1

Hướng dẫn chọn mua cột sắc ký lỏng HPLC Phần 2

  1. Về pha tĩnh

2.2 Cân nhắc phương pháp tách

2.2.2 Phương pháp tách dựa trên độ tích điện

Sắc ký trao đổi ion (IEC hoặc IEX hay gọi tắt là IC) tách các chất dựa trên sự khác biệt trên điện tích bề mặt của từng chất. Nguyên tắc cơ bản của IEC là các chất phân tích mang điện sẽ bị hút vào các phối tử trên bề mặt của pha tĩnh mang điện tích trái dấu. Ứng dụng: thường được sử dụng để phân tích các mẫu sinh học như protein, peptit, amino axit, nucleic axit, glycoprotein.

Có hai loại sắc ký trao đổi ion là sắc ký trao đổi ion dương và sắc ký trao đổi ion âm. Sắc ký trao đổi ion dương được dùng để giữ lại và tách các ion mang điện tích dương trên bề mặt chất nhồi mang điện tích âm và ngược lại đối với sắc ký trao đổi ion âm. Chất trao đổi ion âm và trao đổi ion dương còn được chia ra làm loại trao đổi ion mạnh và trao đổi ion yếu tùy thuộc vào mức độ ion hóa của nhóm chức khi thay đổi nồng độ pH. Một chất trao đổi ion mạnh là cường độ điện tích không đổi trên toàn dải pH, trong khi một chất trao đổi ion yếu lại bị thay đổi khi pH thay đổi.

Người mua cần cân nhắc điện tích của phân tử chất cần phân tích, độ ổn định của phân tử đó khi thay đổi nồng độ pH và điểm đẳng điện tích của chất đó. Khi lựa chọn cột trong IEC sẽ tốt hơn khi có thông tin về điểm đẳng điện của phân tử cần quan tâm.

2.2.3 Phương pháp tách dựa trên kích thước phân tử

Sắc ký rây phân tử (SEC) tách các chất phân tích dựa trên sự kết hợp giữa kích thước, hệ số khuếch tán và tính chất bề mặt của phân tử đó. Phương pháp này thường được ứng dụng cho các phân tử có kích cỡ lớn hoặc các phức hệ phân tử nhỏ như protein hay polyme công nghiệp.

Pha tĩnh có chứa các hạt trơ nhồi vào cột thủy tinh hoặc cột thép. Các hạt này có kích cỡ lỗ rỗng và/hoặc ống dẫn nhỏ và chỉ cho phép các mảnh có kích thước nhất định đi vào. Các phân tử có kích cỡ nhỏ sẽ đi vào sâu hơn, các phân tử lớn hơn chỉ đi sâu được vào một mức nhất định. Những phân tử lớn nhất có thể hoàn toàn nằm ngoài các lỗ rỗng này và dễ dàng bị rửa giải.

Có hai loại sắc ký rây phân tử cơ bản: Sắc ký thẩm thấu gel (GPC) và Sắc ký lọc gel (GFC).

Khi lựa chọn loại cột, người mua cần so sánh đường chuẩn và chọn loại cột phù hợp nhất với khoảng khối lượng phân tử cần phân tích. Trong trường hợp mẫu phân tích có khoảng khối lượng phân tử rộng, người mua có thể cân nhắc sử dụng nhiều loại cột nối tiếp nhau. Ngoài ra người mua cũng nên cân nhắc trước loại dung môi nào sẽ được sử dụng và sau đó chọn cột tương thích với một trong các loại dung môi này.

2.3 Cân nhắc tính chất của hạt nhồi

Người mua đồng thời cũng cần cân nhắc kích thước, hình dạng và tính đối xứng của phân tử hạt nhồi trong cột.

Hầu hết các loại cột mới hiện nay đều có các hạt nhồi hình cầu. Các hạt nhồi hình cầu tạo ra hiệu suất cột và tính ổn định cao hơn đồng thời cho áp suất ngược thấp hơn.

Trong điều kiện các yếu tố không thay đổi, hạt càng nhỏ, hiệu quả tách càng cao. Tuy nhiên khi giảm kích cỡ hạt, áp suất ngược sẽ tăng theo cấp số nhân. Chẳng hạn: cột nhồi có kích thước hạt 3µm sẽ có hiệu quả tăng gấp đôi so với cột nhồi hạt kích thước 5µm, nhưng áp suất sử dụng lại phải tăng gấp 3 lần.

Người mua cũng cần cân nhắc xem chất phân tích là đồng phân đối xứng hay bất đối xứng hoặc là chất thơm. Hầu hết pha tĩnh là các phân tử đối quang (achiral).

Ngoài ra, một vài ứng dụng có thể được tối ưu hóa bằng cách sử dụng loại cột “end-capped”. Loại cột này giúp loại bỏ các tương tác không dự đoán được.

2.4 Khả năng lưu

Khả năng lưu là thời gian mẫu sẽ ở lại trong cột. Đây là một yếu tố quan trọng quyết định chất lượng và thời gian tách. Khả năng lưu của cột bị ảnh hưởng bởi diện tích bề mặt và lượng % cacbon có trong chất nhồi. Kích thước lỗ lọc và thể tích chất nhồi cũng rất quan trọng khi xác định khả năng lưu của cột, vì diện tích bề mặt tỷ lệ nghịch với kích thước lỗ. Cột có kích thước lỗ lọc lớn hơn sẽ có thời gian lưu thấp hơn. Dải kích thước thông thường từ 100-1,000 angstroms, phân tích protein và peptides thường dùng loại có kích thước khoảng 300 angstroms; với các phân tử nhỏ là khoảng 100 angstroms.

Để tăng tuổi thọ và bảo vệ cột, người dùng có thể sử dụng cột bảo vệ hoặc màng lọc để loại bỏ các chất bẩn đi vào cột.

  1. Cân nhắc kích thước cột

Loại cột sắc ký kích thước lớn giúp đẩy nhanh tốc độ quá trình phân tích, tuy nhiên loại cột có kích thước nhỏ lại cho độ nhạy cao hơn và dó đó được sử dụng phổ biến hơn trong phân tích.

Chiều dài cột được xác định thông qua số lượng và loại hợp chất cần phân tích. Loại cột dài thường cho độ phân giải và độ nhạy tốt hơn tuy nhiên lại có thời gian lưu dài hơn và cần áp suất lớn hơn.

Đường kính trong (ID) của cột cũng là yếu tố cần xem xét vì nó ảnh hưởng tới cả độ nhạy và độ chọn lọc (độ phân giải). Phổ biến nhất là cột có đường kính 4.6mm

Loại cột có ID nhỏ sẽ có độ nhạy cao hơn đối với cùng lượng mẫu bơm vào, sử dụng ít thể tích pha động hơn. Điểm trừ lớn nhất của loại cột này là thể tích mẫu phân tích bị giảm xuống.

fig-12

Nguồn: www.chromacademy.com

Tóm lại:

  • Cột có ID lớn (>10mm) thường được dùng để tinh sạch một số lượng mẫu lớn;
  • Cột phân tích (4,6mm) là loại thường được sử dụng nhất và thường dùng trong phân tích định lượng.
  • Loạt cột có đường kính nhỏ (1-2mm) thường dùng trong các ứng dụng cần độ nhạy cao
  • Cột capillary (ID<0,3mm) thường dùng trong những kỹ thuật đặc biệt ví dụ như khối phổ.
  1. Xu hướng trong tương lai

Loại cột mới nhất được phát triển hiện nay cho HPLC là loại “fused-core column” – là loại cột được nhồi loại silicagel có kích thước nhỏ hơn 2µm, với lõi hạt rắn, được phủ một lớp màng mỏng và xốp bên ngoài, cho hiệu suất tách cao hơn -tương đương với UHPLC nhưng ở áp suất thông thường. Ưu điểm lớn nhất của loại cột này so với phương pháp UHPLC đó là việc không thể chuyển giao các phương pháp thiết lập cho UHPLC hoặc HPLC giữa hai phòng xét nghiệm trừ khi cả hai phòng xét nghiệm này có cùng loại thiết bị, nhưng khi sử dụng cột “fused-core” các phòng xét nghiệm khác nhau chỉ cần có chung loại cột là có thể thực hiện được.

HILIC và HIC sẽ tiếp tục được sử dụng rộng rãi trong tương lai. Ngoài ra các dòng cột sắc ký Mix-mode cũng sẽ được sử dụng và phát triển mạnh trong tương lai.

Hệ thống sắc ký lỏng 2 chiều (2D-HPLC) hứa hẹn là một kỹ thuật phát triển mạng trong tương lai. Kỹ thuật này cho phép sử dụng kết hợp 2 loại cột riêng biệt với phương pháp tách khác nhau.

Nguồn: SelectScience.net

Tổng hợp và dịch: BioMedia Việt Nam

Các bài viết cùng chủ đề

Sắc ký: Hướng dẫn chọn mua cột sắc ký lỏng HPLC (phần 2)

Xem thêm >>> Hướng dẫn chọn mua cột sắc ký lỏng HPLC Phần 1 Hướng dẫn chọn mua cột sắc ký lỏng HPLC Phần 2 Về...