Hotline 247
04 6662 6362
 
Hà Nội
0968 378 899
 
Hồ Chí Minh
01289 777 888

Giải quyết các vấn đề trong quá trình tách chiết ARN

BioMedia

Tách ARN (RNA isolation) là một trong những quy trình phức tạp, mỗi người sẽ có những phương pháp, thủ thuật riêng để tách ARN nguyên vẹn từ mẫu của họ. Mặc dù vậy ở mức độ nào đó, sự thành công của quá trình tách ARN rất khó dự đoán, tuy nhiên có một vài vấn đề thường xuyên xảy ra vẫn có thể được giải quyết hợp lý.

Trong quá trình tách ARN từ mẫu mô và tế bào, có bốn vấn đề chính như sau:

Vấn đề 1: ARN nhiễm ADN tổng số (genomic DNA)

Nhận biết: Trong trường hợp này, trên ảnh điện di sẽ xuất hiện các vệt smear khối lượng phân tử cao hoặc mẫu đối chứng– RT (bao gồm toàn bộ thành phần cần cho phản ứng RT-PCR, ngoại trừ enzyme reverse transcriptase) lên băng sau khi tiến hành PCR.

Nguyên nhân: Bất cứ quy trình phân tách ARN nào cũng đều xuất hiện những vết ADN. Điều này đúng khi xử lý mẫu với hỗn hợp dung môi TRIzol (phenol) và màng lọc xoay silica. Nguyên nhân có thể do sự đứt gãy không hoàn toàn của ADN tổng số trong quá trình nghiền đồng thể (homogenization). Trong phương pháp sử dụng phenol, pH của phenol chính là yếu tố then chốt (cần pH acid) và kỹ năng thao tác với pipet ở pha nước sẽ quyết định mức độ nhiễm ADN.

Giải pháp: ADN tổng số cần được làm đồng nhất hoàn toàn nhờ sử dụng các phương pháp như phá vỡ cấu trúc ADN bằng một máy đập hạt vận tốc cao (high velocity bead beater) hoặc một polytron rotor stator. Mẫu sẽ được làm nóng trong suốt quá trình nghiền đồng thể nhưng làm lạnh mẫu trong guanidine sẽ khiến muối này kết tủa. Do đó, cần cân bằng thời gian nghiền đồng thể với thời gian làm lạnh mẫu tới nhiệt độ phòng.

Sử dụng DNase là cách tốt nhất để loại bỏ ADN tổng số (Hình minh họa). Bộ kit RTS DNase™ chứa enzyme DNase có hoạt độ cao, bền ở nhiệt độ phòng có thể loại bỏ ADN hiệu quả. Sau bước loại ADN, resin được dùng để loại bỏ enzyme DNase mà không cần dùng nhiệt độ hay EDTA. Kit này được khuyến khích sử dụng cho các mẫu giàu ADN tổng số (ví dụ mô lá lách), các mẫu đã được tinh sạch trước bước xử lý với DNase.

Các phương pháp “on-column” (trong cột) có thể sử dụng với các mẫu nhiễm ít ADN tổng số.

Ảnh điện di: Sử dụng DNase loại bỏ ADN tổng số khỏi mẫu ARN

(Nguồn ảnh: https://mobio.com/dnasetm-max-kit-1076.html)

Vấn đề 2: ARN phân hủy/ ARN không nguyên vẹn

Nhận biết: Các băng rARN xuất hiện các vệt smear trên bản gel hoặc băng 18S đậm hơn nhiều so với băng 28S.

Ảnh điện di: ARN bị phân hủy và ARN nguyên vẹn (M. Marker, 1. ARN bị phân hủy và 2. ARN nguyên vẹn lên băng 18S và 28S)

(Nguồn ảnh: https://www.thermofisher.com)

Nguyên nhân: Sự phân hủy ARN diễn ra ở một vài thời điểm trong suốt quy trình nên rất khó để xác định chính xác hiện tượng này xảy ra trong giai đoạn thu mẫu (collection), bảo quản (storage), tách chiết (extraction) hay phân tách (isolation).

Giải pháp: Nếu vấn đề này xuất hiện trong quá trình bảo quản, hãy đảm bảo mẫu sau khi thu ngay lập tức được giữ trong nitơ lỏng hoặc ở -80oC; đối với mẫu là mô động vật, sử dụng RNALater và giữ ở -20oC.

Nếu vấn đề xuất hiện trong quá trình tách chiết, hãy thêm beta-mercaptoethanol (BME) vào đệm ly giải (lysis buffer). Sử dụng 10 ul BME 14.3 M/ 1ml đệm. BME sẽ bất hoạt RNases và giúp giữ ổn định mẫu trong suốt quá trình tách chiết.

Nếu mẫu được lấy ra từ tủ đông và không nằm trong dung dịch bảo quản, không được rã đông. Nhanh chóng làm đồng nhất mẫu trong BME. Chú ý ly giải mẫu hoàn toàn.

Sự phân hủy bởi RNase có thể xảy ra sau khi phân tách do vậy cần đảm bảo rằng nước sử dụng cho quá trình rửa giải (elution) và tái hòa tan (resuspension) không nhiễm RNase.

Vấn đề 3: Chất ức chế ARN

Nhận biết: Tỷ số 260/230 thấp (dưới 1.0) hoặc tỷ số 260/280 thấp.

Nguyên nhân: Tỷ số 260/230 thấp cho thấy hỗn hợp chứa muối guanidine hoặc các chất ức chế hữu cơ như acid humic, polysaccharides. Các muối guanidine bất hoạt RNase nhưng cũng ức chế các protein như enzyme RT. Tỷ lệ 260/280 thấp chứng tỏ ARN nhiễm protein.

Giải pháp: Trường hợp tỷ số 260/230 thấp, cách tốt nhất là rửa mẫu thêm nhiều lần. Nếu TRIzol kết tủa, hãy rửa với ethanol để khử muối. Trường hợp sử dụng cột silica, rửa thêm vài lần bằng ethanol 70-80% để loại bỏ muối. Với các mẫu được tinh sạch chưa hoàn toàn, hãy dùng ethanol.

Đối với các chất ức chế khác như acid humic và polysaccharides, cần tinh sạch lại mẫu trong một cột khác và rửa sạch trước khi rửa giải. Một vài hợp chất sẽ không được loại bỏ khỏi ARN (hoặc ADN) bằng phương pháp thông thường vì chúng tương tự acid nucleic. Như vậy, nên cân nhắc sử dụng các kỹ thuật loại bỏ chất ức chế cho mẫu tự nhiên.

Tỷ số 260/280 thấp chủ yếu là do sử dụng lượng mẫu đầu vào lớn khiến protein không được loại bỏ hoàn toàn. Hãy làm sạch mẫu bằng phương pháp của bạn hoặc sử dụng phenol:chloroform hoặc thêm các muối gắn, ethanol để gắn với một màng lọc silica khác. Protein sẽ dễ dàng được loại bỏ. Lần thí nghiệm sau, cần chú ý sử dụng lượng mẫu ít hơn.

Vấn đề 4: Lượng ARN thu được thấp

Lượng ARN thu được có sự khác biệt rõ ràng giữa các kiểu tế bào, các loại mô khác nhau. Đối với ARN máu, hiệu suất thu được khác biệt tùy người.

Nguyên nhân: Nếu lượng ARN thu được thấp hơn dự đoán và ARN vẫn nguyên vẹn thì sự phân hủy ARN không phải là nguyên nhân của hiện tượng này. Khi đó, quá trình nghiền đồng thể có thể là chưa hoàn toàn. Để phân tách ARN, bước ly giải đóng vai trò quan trọng. Các mẫu mô được lưu giữ trong RNALater thường khó làm đồng nhất hơn. Sai sót trong tính toán khối lượng mô hoặc số lượng tế bào có thể lý do khiến lượng ARN thu được thấp. Trong trường hợp này, số lượng tế bào thực tế có thể ít hơn tính toán.

Giải pháp: Trường hợp ARN nguyên vẹn: chú ý vào phương pháp nghiền đồng thể, đảm bảo ADN tổng số bị phân cắt toàn bộ và ARN giải phóng hoàn toàn từ các tế bào vì bất cứ mảnh mô nào còn sót lại đều mang ARN.

Sử dụng công cụ tính toán thật chính xác để định lượng chuẩn các mảnh mô hay đếm đúng số lượng tế bào.

Nếu ARN bị phân hủy dẫn đến lượng thu được thấp, vấn đề có thể nảy sinh trong giai đoạn bảo quản hoặc nghiền đồng thể quá mạnh hay gia nhiệt quá lâu (nên tiến hành theo chu kỳ: gia nhiệt 30-45s -dừng 30s). Chú ý cắt các mẫu mô và nhanh chóng đưa chúng vào đệm ly giải guanidine lạnh (hoặc TRIzol) để ngăn chặn hoạt động của RNase.

Với màng lọc xoay silica, cần đảm bảo quá trình rửa giải ở cột đủ để giải phóng ARN ra khỏi màng. Sử dụng thể tích nước lớn hơn trong quá trình rửa giải sẽ cho lượng ARN nhiều hơn.

Kết luận

Sự phân tách ARN từ các nguồn khác nhau đều tuân theo một quy trình tương tự. Trong đó, quá trình nghiền đồng thể là bước đầu tiên và quan trọng nhất. Quá trình này được thực hiện tốt sẽ giúp các tế bào nhanh chóng bị phá vỡ, RNases bị bất hoạt trong đệm ly giải và ADN tổng số phân hủy tới kích thước dễ dàng được rửa trôi.

Nguồn: http://bitesizebio.com/2345/troubleshooting-rna-isolation/

Dịch giả Nguyễn Ngọc Nam

Biên soạn BioMedia VN

Các bài viết cùng chủ đề

Giải quyết các vấn đề trong quá trình tách chiết ARN

Tách ARN (RNA isolation) là một trong những quy trình phức tạp, mỗi người sẽ có những phương pháp, thủ thuật riêng để tách ARN...

Quy trình chuẩn bị ARN cho phân tích

Quy trình chuẩn bị ARN cho phân tích gồm 4 bước chính: Bước 1: Thu thập và bảo quản mẫu Bước 2: Tách chiết ARN Bước 3: Định lượng...