Hotline 247
04 6662 6362
 
Hà Nội
0968 378 899
 
Hồ Chí Minh
01289 777 888

Cột ly tâm silica dùng trong việc tách chiết ADN/ ARN hoạt động như thế nào?

BioMedia

Ngày nay, phần lớn các phòng thí nghiệm đều sử dụng các bộ kit thương mại dùng cột ly tâm cho việc tách chiết acid nucleic. Cột ly tâm chứa chất bám silica (silica resin) cho phép gắn chọn lọc ADN/ ARN, phụ thuộc vào điều kiện muối và bị ảnh hưởng bởi các nhân tố khác do phương pháp tách chiết. Khi mọi thứ đều tốt đẹp, những bộ kit thương mại này sẽ giúp toàn bộ quá trình trở nên dễ dàng và nhanh chóng hơn là phương pháp truyền thống. Tuy nhiên, chúng ta thực sự không biết được cơ chế thực sự bên trong của những bộ hóa chất bí ẩn và các bộ dung dịch tách chiết ADN trong các kit, do đó lẽ dĩ nhiên việc giải quyết các rắc rối sẽ càng khó khăn hơn.

Bài viết này sẽ trình bày hoạt động của cột ly tâm silica sử dụng trong các bộ kit và giải thích chi tiết từng bước của quá trình, đồng thời, cũng điểm qua một vài vấn đề thường gặp khi sử dụng cột silica để cung cấp thêm kiến thức cũng như hiểu biết về quá trình này tới những người làm việc trong phòng thí nghiệm.

Quá trình ly giải

Khi bắt đầu tiến hành quá trình ly giải, chúng ta cần xác định thứ mình muốn là ADN hay ARN, nhìn chung thì thường sử dụng đệm ly giải chứa nồng độ các muối chaotropic (muối hoạt động bề mặt) cao. Các chaotrope (chất hoạt động bề mặt) sẽ làm mất ổn định liên kết hydro, lực van der Walls và tương tác kị nước. Protein cũng bị mất ổn định, bao gồm các nuclease, và sự liên kết của acid nucleic với nước cũng bị cản trở, tạo điều kiện để chuyển chúng lên màng silica.

Các muối chaotropic gồm có guanidine HCl, guanidine thiocyanate, urea, và lithium perchlorate.

Bên cạnh các chaotrope, đệm ly giải cũng chứa các chất biến tính để giúp hòa tan các protein và ly giải ADN. Các enzyme được sử dụng cho quá trình ly giải tùy thuộc vào từng loại mẫu. Protenase K là một trong số các enzyme hoạt động thực sự rất tốt trong đệm biến tính này; protein càng bị biến tính, nghĩa là Protenase K hoạt động càng tốt. Tuy nhiên, enzyme lysozyme lại không hoạt động được trong điều kiện biến tính của đệm ly giải, do vậy, việc xử lý lysozyme cần phải được tiến hành trước khi thêm các muối biến tính.

Đối với việc tách plasmid, quá trình ly giải rất khác so với việc tách ARN hoặc ADN tổng số bởi vì việc đầu tiên là cần tách plasmid khỏi ADN tổng số. Nếu bạn cho các chất chaotrope vào, đồng nghĩa với việc bạn sẽ giải phóng rất nhiều thành phần cùng một lúc, và khi đó không thể phân tách hoàn toàn phân tử ADN vòng nhỏ từ nhiễm sắc thể có khối lượng cao. Vì vậy trong quá trình tách plasmid, các chất chaotrope không được thêm vào trước khi đệm ly giải và các muối được sử dụng trong việc gắn.

Quá trình gắn

Các muối chaotropic rất quan trọng đối với bước ly giải và bước gắn acid nucleic lên màng silica. ADN được gắn lên màng ở lực ion cao và sau đó rửa giải (elute) ở lực ion thấp. 

Gắn ADN lên màng trong sự có mặt của muối chaotropic. (Nguồn: http://photoscience.la.asu.edu/)

Để tăng cường khả năng gắn cả acid nucleic lên màng, các alcohol cũng được thêm vào giai đoạn này. Hầu hết người ta thường sử dụng ethanol nhưng trong một vài trường hợp dùng isopropanol.

Nồng độ và thể tích của ethanol được sử dụng đều có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của quá trình gắn.

  • Nếu sử dụng lượng quá lớn ethanol (về nồng độ hoặc thể tích) sẽ khiến acid nucleic dễ bị đứt gãy thành các mảnh nhỏ, các mảnh này làm ảnh hưởng đến độ đọc UV260 và làm giảm sản lượng mẫu thu được.
  • Ngược lại nếu quá ít ethanol (về nồng độ hoặc thể tích) thì sẽ rất khó có thể rửa sạch tất cả các muối trên màng. Điều cần nhớ ở đây là ethanol có ảnh hưởng đến việc gắn và khối lượng ethanol thêm vào cần được tối ưu hóa khi bạn sử dụng bất kì bộ kit nào. Sự thay đổi trong bước này có thể làm thay đổi sản phẩm bạn thu hồi nên nếu bạn gặp vấn đề gì hoặc muốn giải quyết các rắc rối, hãy nghĩ ngay đến bước này.

Một cách khác để kiểm tra các rắc rối là giữ lại toàn bộ dịch chảy qua sau quá trình gắn và tủa lại dung dịch đó để quan sát xem liệu bạn có thể tìm thấy acid nucleic không. Nếu bạn có sử dụng chất biến tính chứa SDS trong bước ly giải, thì hãy thử sử dụng NaCl để kết tủa SDS, tránh làm nhiễm chất biến tính vào ADN hoặc ARN.

Quá trình rửa

Dung dịch ly giải của bạn cần được ly tâm để có thể đi qua màng silica, sau ly tâm chỉ ADN hoặc ARN được giữ lại trên màng, còn các thành phần khác như protein, poysaccarid,... sẽ bị rửa trôi. Nhưng, lúc này, màng vẫn có thể còn dính các protein hay các muối bị sót lại. Nếu mẫu có nguồn gốc từ thực vật, thì khi đó sẽ còn lại polysaccarid hoặc có thể là một vài sắc tố dính trên màng. Còn nếu mẫu lấy từ máu, màng khi đó sẽ có màu nâu hoặc vàng.

Mục đích của bước rửa là giúp loại bỏ các thành phần không sạch. Thông thường có hai lần rửa, mặc dù còn tùy thuộc vào từng loại mẫu. Dung dịch rửa lần một thường có một lượng nhỏ muối chaotropic nhằm loại bỏ protein và các chất màu. Tiếp đó sẽ là bước rửa ethanol để loại bỏ muối. Nếu như sản phẩm không chứa nhiều protein như plasmid hoặc sản phẩm PCR thì chỉ cần một bước rửa ethanol là đủ. Việc loại bỏ các muối chaotropic là rất quan trọng để làm tăng sản lượng và độ tinh sạch của ADN hoặc ARN. Một số các kit thậm chí còn khuyến cáo rửa cột hai lần với ethanol. Vì nếu sau khi rửa cột, muối vẫn còn, thì lúc đó việc elute (rửa giải) các acid nucleic cũng rất kém, độ đọc A230 sẽ cao, kết quả là tỉ lệ A260/A230 thấp.

Làm khô bằng ly tâm

Sau bước rửa bằng ethanol, hầu hết các quy trình đều có một bước ly tâm để là làm khô cột. Việc này giúp loại bỏ ethanol và là cần thiết để có dung dịch rửa giải (eluant) sạch. Khi đệm Tris 10mM hoặc nước được thêm vào màng để rửa giải, các acid nucleic sẽ bị hydrat hóa và được giải phóng nhanh chóng ra khỏi màng. Nhưng nếu như cột vẫn còn dính ethanol, thì các axit nucleic sẽ không thể bị hydrate hóa hoàn toàn và hiệu suất rửa giải cũng thấp.

Nếu bỏ qua bước làm khô cột sẽ dẫn đến việc bị nhiễm ethanol và sản lượng thu được thấp.

Dấu hiệu nhận biết chính của vấn đề này chính là khi bạn cho (load) mẫu vào các giếng trên gel agarose để điện di, ADN sẽ không chìm mà nổi trong đệm, kể cả khi bạn đã cho dye. Dấu hiệu khác của việc nhiễm ethanol là khi để mẫu ở -20oC, nó sẽ không bị đóng đá.

Quá trình rửa giải (Elution)

Bước cuối cùng của quy trình là giải phóng các ADN hoặc ARN sạch khỏi màng silica. Đối với tách chiết ADN, người ta thường dùng dung dịch muối Tris 10 mM ở pH 8-9. ADN ổn định hơn khi ở pH gần với pH trung tính (pH 7) và sẽ hòa tan nhanh hơn khi ở trong đệm. Điều này là đúng kể cả với các hạt tủa ADN. Còn đối với việc dùng nước để rửa giải (elution) thì ADN với khối lượng phân tử lớn có thể không bị hydrat hoàn toàn do nước thường có pH thấp, khoảng 4 - 5. Để việc rửa giải đạt hiệu quả tối đa, bạn có thể ủ màng với đệm rửa giải khoảng vài phút trước khi ly tâm.

Ngược lại, ARN ổn định ở pH hơi acid và do đó, nước thường hay được dùng để rửa giải ARN vì chúng cũng dễ dàng hòa tan trong nước.

Quy trình tách chiết ADN bằng cột silica đơn giản. (Nguồn: http://www.yeastern.com/)

Những điều kiện nào khác có thể gây ảnh hưởng xấu đến cột silica?

  • Lượng ADN thu hồi thấp: Nếu đã có lần bạn thu được sản lượng thấp hơn lượng bạn mong đợi trong một mẫu thì một vài nhân tố sau có thể ảnh hưởng đến việc này:

+ Quá trình ly giải: việc ly giải không hoàn toàn thường là nguyên nhân chính của việc lượng ADN thu được thấp.

+ Điều kiện gắn lên màng không đúng.

+ Cần sử dụng ethanol sạch chất lượng cao (đúng 100%) khi pha loãng đệm hoặc khi thêm vào bước gắn. Ethanol chất lượng thấp hoặc đã để lâu có thể chứa nước và nồng độ khi đó không đúng 100%. Nếu đệm rửa không chuẩn, bạn sẽ làm rửa trôi mất ADN hoặc ARN.

  • Độ tinh sạch thấp

        + Nếu mẫu bị nhiễm protein (tỉ số A260/ 280 thấp), có thể là do lượng mẫu bạn sử dụng ban đầu quá nhiều và protein đã không được loại bỏ hoặc hòa tan hoàn toàn.

       + Nếu mẫu có tỉ số A260/230 không tốt, là do muối còn sót lại từ việc gắn hoặc từ đệm rửa. Cần đảm bảo rằng sử dụng ethanol chất lượng tốt nhất để pha đệm rửa và nếu vấn đề này tiếp tục xảy ra, hãy  tiến hành thêm một bước rửa cột nữa.

        + Một vài mẫu có nhiều chất ức chế hơn các mẫu khác. Các mẫu có tính chất môi trường thường có xu hướng dễ tinh sạch bởi các thành phần humic được hòa tan trong quá trình tách. Humic tương tự như ADN và rất khó loại bỏ khỏi màng silica. Đối với loại mẫu này, kỹ thuật điển hình là loại bỏ protein và humic trước khi cho lên cột.

  • Thoái hóa (Degradation):

        + Vấn đề này thường được quan tâm hơn đối với quá trình tách ARN, bạn có thể đọc thêm trong bài viết Giải quyết các vấn đề trong quá trình tách chiết ARN để thu được những lời khuyên hữu ích. Chủ yếu với ARN, sự thoái hóa diễn ra khi việc bảo quản mẫu không đúng cách hoặc các dung dịch ly giải không đủ hiệu quả, giả sử trong trường hợp bạn đã rửa giải với nước không chứa RNAase.

         + Còn trong quá trình tách ADN, sự thoái hóa không phải là một vấn đề lớn bởi vì với PCR, ADN dù có bị đứt gãy thì nó vẫn hoạt động tốt. Nhưng nếu bạn hy vọng ADN không bị đứt gãy nhiều, bạn có thể sử dụng phương pháp ly giải siêu mạnh.

  • Tinh sạch sản phẩm PCR

      + Tinh sạch sản phẩm PCR bằng công nghệ cột ly tâm silica là dễ dàng nhất, bởi vì đơn giản nó liên quan đến việc thêm nồng độ cao của muối gắn (thường là từ 3 – 5 thể tích muối trên một thể tích phản ứng PCR) và sau đó tiến hành ly tâm cột.

      + Nên khi việc tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit thất bại, nó có thể khiến chúng ta rất bực bội, khó chịu. Khi đó, câu hỏi đầu tiên cần đặt ra là: “Bạn đã kiểm tra kết quả phản ứng PCR trên gel chưa?” bởi vì bạn không thể đo nồng độ để biết chính xác lượng sản phẩm PCR, do có quá nhiều thành phần phản ứng PCR hấp thụ ở bước sóng UV 260 như: các nucleotide, chất biến tính, muối, và mồi. Do đó, việc thất bại trong quá trình tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit có thể do phản ứng PCR bị thất bại và ngay từ đầu đã không có sản phẩm phản ứng nào.

      + Nhưng nếu bạn thu được nhiều sản phẩm PCR, cách giải quyết tốt nhất là giữ lại các dịch chảy qua của bạn sau quá trình gắn. Nếu ADN không gắn lên màng thì nó phải ở đó. Bạn luôn có thể giải quyết được và bắt đầu lại từ đầu. Và sau đó hãy gọi cho bên hỗ trợ kỹ thuật và yêu cầu thay thế bộ kit khác.

Nguồn bitesizebio.com

Dịch và tổng hợp BioMedia VN

Các bài viết cùng chủ đề

Cột ly tâm silica dùng trong việc tách chiết ADN/ ARN hoạt động như thế nào?

Ngày nay, phần lớn các phòng thí nghiệm đều sử dụng các bộ kit thương mại dùng cột ly tâm cho việc tách chiết acid...

Southern Blot- Sơ lược quy trình và xử lý một số vấn đề thường gặp

1. Sơ lược về quy trình Southern Blotting Southern blot được đặt tên theo giáo sư Edward M. Southern – người đã phát minh kỹ thuật này...