Hotline 247
04 6662 6362
 
Hà Nội
0968 378 899
 
Hồ Chí Minh
01289 777 888

SDS – PAGE hoạt động như thế nào?

BioMedia

Điện di polyacrylamide với SDS (viết tắt là SDS - PAGE) là một kỹ thuật được sử dụng thường xuyên trong phòng thí nghiệm nhằm mục đích phân tách các protein dựa trên khối lượng phân tử và tốc độ di chuyển khác nhau của chúng qua gel polyacrylamide, dưới tác dụng của điện trường một chiều. Mặc dù kỹ thuật này được sử dụng rất thường xuyên nhưng nhiều người vẫn chưa hiểu hoàn toàn về nó, do đó bài báo này sẽ cung cấp những thông tin đầy đủ nhất về “quá trình hoạt động của SDS - PAGE”.

Xây dựng mối liên hệ giữa tốc độ điện di và khối lượng phân tử của protein

Theo lý thuyết, tốc độ di chuyển của bất kỳ vật chất nào trong điện trường phụ thuộc vào điện tích, kích thước phân tử của vật đó, và cường độ của điện trường. Nhưng vấn đề ở đây là, điện tích và kích thước phân tử của các protein tự nhiên (tồn tại ở trạng thái gấp khúc) không phụ thuộc vào khối lượng phân tử của protein đó. Điện tích của một protein phụ thuộc vào thành phần amino acid của nó, còn kích cỡ  phân tử lại phụ thuộc vào cấu trúc không gian bậc 3 của protein. Do đó, các phân tử protein tự nhiên khác nhau có cùng khối lượng phân tử có thể di chuyển với tốc độ khác nhau trong cùng một điện trường, tùy theo điện tích và cấu trúc 3D của các protein đó.

Như vậy, để có thể phân tách được các protein trong điện trường bằng khối lượng phân tử của chúng, ta cần phá vỡ cấu trúc không gian của protein, đưa protein về dạng cấu trúc bậc 1, và cân bằng điện tích của các protein khác nhau. Đây chính là công việc của SDS - sodium dodecyl sulphate.

Chức năng của SDS

SDS được dùng để phá vỡ cấu trúc bậc 3 của protein. SDS được thêm vào đệm điện di cùng với những chất khử như DDT (dithiotheitol) hoặc B-ME (beta-mercaptoethanol) để phá vỡ liên kết disulfide trong protein, biến protein từ dạng không gian (cấu trúc bậc 3) về dạng thẳng (cấu trúc bậc 1). Đồng thời SDS tích điện âm cho protein, làm cho điện tích của phân tử protein lớn hơn hẳn điện tích có sẵn của nó (tồn tại ở gốc R trong amino acid). SDS bám lên protein theo một tỷ lệ ổn định (xấp xỉ 1.4g SDS/ 1g protein), và điều này làm cho điện tích mới của phân tử protein tỷ lệ với khối lượng phân tử của nó.

SDS được thêm vào trong thành phần gel để duy trì trạng thái biến tính của protein (duỗi thẳng, tích điện âm) trong suốt quá trình điện di.

Hình 1: Quá trình biến tính protein của SDS

Như vậy, yếu tố duy nhất ảnh hưởng tới sự di chuyển của các phân tử protein được biến tính bởi SDS chính là kích thước phân tử của chúng. Phân tử protein được biến tính và tích điện âm bởi SDS sẽ tồn tại ở dạng thẳng, có chiều rộng khoảng 18 Å, chiều dài tỷ lệ với khối lượng phân tử (do tồn tại ở dạng thẳng). Kích thước phân tử protein (cùng với đó là tốc độ di chuyển trong gel) được quyết định bởi khối lượng phân tử của protein. Điện tích của protein không ảnh hưởng tới quá trình điện di, do các phân tử protein đã được tích điện âm bởi SDS, và điện tích của mỗi protein lại tỷ lệ với khối lượng phân tử của chính nó.

Do đó, dưới tác dụng của điện trường, các phân tử protein đã được biến tính sẽ di chuyển về phía cực dương với tốc độ khác nhau, tùy theo kích thước phân tử của chúng. Sự khác nhau này sẽ được thể hiện một cách rõ ràng khi phân tử protein chạy qua gel. Gel polyacrylamide không bị ảnh hưởng bởi các hóa chất biến tính protein như SDS, B-TM,… và có thể được pha với nhiều nồng độ khác nhau, tạo ra các loại gel có kích thước lỗ gel khác nhau, phù hợp với các quá trình phân tách khác nhau, do đó được sử dụng một cách rộng rãi.

Hệ đệm điện di không liên tục và lớp gel cô

Trong quá trình điện di, đệm điện di có vai trò là môi trường để  duy trì dòng điện ổn định chạy trong gel. Loại đệm điện di được sử dụng phổ biến nhất trong SDS – PAGE là hệ đệm không liên tục Laemmli. “Không liên tục” nghĩa là loại đệm được sử dụng trong gel và trong bể điện di khác nhau. Hệ đệm không liên tục Laemmli gồm lớp gel cô có pH = 6.8, lớp gel tách có pH = 8.8 và đệm điện di ở pH = 8.3, trong đó lớp gel cô có nồng độ acrylamide thấp hơn so với lớp gel tách.

Hình 2: Hệ đệm không liên tục Laemmli

Vậy thì sự khác biệt về pH có vai trò gì trong quá trình điện di? Glycine trong đệm điện di có thể tồn tại ở 3 trạng thái khác nhau là trạng thái trung hòa về điện, tích điện âm và tích điện dương, tùy vào pH của môi trường. Điều khiển trạng thái tích điện của glycine bởi các hệ đệm khác nhau là chức năng chính của hệ đệm không liên tục, và thông qua lớp gel cô để cố định lại protein trước khi phân tách.

Hình 3: Ba trạng thái tích điện khác nhau của phân tử glycine.

Khi quá trình điện di bắt đầu, các ion glycine tích điện âm trong đệm (có pH = 8.3) được đẩy vào trong lớp gel cô. Dưới pH = 6.8 ở đây, các phân tử glycine bị chuyển thành dạng trung hòa về điện tích, làm cho tốc độ di chuyển của chúng bị giảm đi đáng kể trong điện trường. Trái ngược với glycine, các ion Cl di chuyển nhanh hơn trong điện trường, và chúng hình thành nên một lớp ion ở phía trước các phân tử glycine. Sự di chuyển của ion Clvề phía cực dương của bể điện di tạo nên một vùng hẹp có gradient điện áp chênh nhau rất lớn ở 2 đầu, phía trước là ion Cl có khả năng di chuyển nhanh, phía sau là ion glycine trung tính. Toàn bộ các phân tử protein được tra vào giếng được cô lại giữa 2 lớp ion Clvà glycine.

Khi phân tử chạy tới lớp gel tách có pH = 8.8, các phân tử glycine chuyển sang trạng thái tích điện âm, di chuyển nhanh hơn các ion phân tử Cl; chúng vượt qua các phân tử Clở phía trước để di chuyển về cực dương. Điều này làm cho các phân tử protein bị cố định dưới hình dạng các băng ở vùng tiếp giáp giữa 2 lớp gel cô và gel tách. Cùng với đó, do nồng độ acrylamide trong lớp gel tách lớn hơn lớp gel cô, các phân tử protein sẽ di chuyển chậm đi, và quá trình phân tách bắt đầu diễn ra.

Nếu như bạn không sử dụng lớp gel cô, điều gì sẽ xảy ra? Các giếng trên gel acrylamide có độ sâu khoảng 1cm, và thường phải được tra đầy để có đủ protein cho quá trình điện di. Nếu như không có lớp gel cô, phía trên lớp gel tách sẽ là lớp mẫu có độ dày tới 1cm. Khi đó, protein trong mẫu sẽ di chuyển hết vào trong lớp gel tách vào các thời điểm khác nhau, dẫn tới các băng điện di sẽ bị smear. Chức năng chính của lớp gel cô là làm cho protein bị nén lại dưới dạng các băng, đồng thời chắc chắn rằng các băng protein sẽ di chuyển vào trong lớp gel tách trong cùng 1 thời điểm.

Khi protein di chuyển vào lớp gel tách, chúng sẽ được phân tách dựa trên khối lượng phân tử. Protein có khối lượng phân tử lớn sẽ di chuyển chậm hơn protein có khối lượng phân tử nhỏ hơn. Tùy vào loại protein cần phân tách mà nồng độ polyacrylamide có thể được điều chỉnh cho phù hợp. Đối với các trường hợp cần phổ phân tách lớn, hoặc đối với các protein khó phân tách, có thể sử dụng gel gradient gồm nhiều lớp acrylamide có nồng độ khác nhau.

Tác giả: TS. Nick Oswald

Nguồn bitesizebio.com

Link bài gốc: http://bitesizebio.com/580/how-sds-page-works/

Dịch giả Nguyễn Khánh Toàn

Biên soạn BioMedia VN

Các bài viết cùng chủ đề

SDS – PAGE hoạt động như thế nào?

Điện di polyacrylamide với SDS (viết tắt là SDS - PAGE) là một kỹ thuật được sử dụng thường xuyên trong phòng thí nghiệm nhằm...

Bản tin việc làm ngày 14/3/2016

  1. Điều Phối Viên Nghiên Cứu Lâm Sàng (CRC Leader) - Công Ty TNHH Hỗ Trợ Nghiên Cứu Lâm Sàng Big Leap       ...

Viện nghiên cứu môi trường nông nghiệp nông thôn tuyển dụng

(Yêu cầu trình độ đại học Khá/ Giỏi) 1. Chuyên ngành: Môi trường - Trường đại học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam, ĐH Khoa học...