Định lượng Acid nucleic bằng hệ thống Digital PCR 

Digital PCR-dPCR  cho phép định lượng nhanh và chính xác các alen hiếm có trong mẫu.

Real time PCR là phương pháp định lượng có nhiều ưu điểm hơn kỹ thuật dPCR đang phát triển hiện nay. Jim Huggett, nhà khoa học hàng đầu trong lĩnh vực định lượng nucleic acid tại LGC, Viện đo lường tiêu chuẩn quốc gia Anh trong lĩnh vực đo lường các chỉ tiêu sinh học và hóa học cho rằng “phương pháp này có chi phí rẻ hơn và có khả năng phân tích tốt với lượng đầu vào cao, độ chính xác khá cao cho phần lớn mẫu bạn cần định lượng bằng phương pháp PCR”.

Tuy nhiên, có nhiều ứng dụng mà dPCR có lẽ là cách giải quyết duy nhất có thể sử dụng được. Ví dụ, tìm đột biến hiếm trong rất nhiều trình tự hoang dại, kiểm soát sự thay đổi tinh vi trọng lượng virus hoặc theo dõi sự gia tăng số bản sao của virus. Ở đây chúng tôi xem xét các dạng dPCR khác nhau, ưu, nhược điểm của chúng cũng như đưa ra các khuyến cáo để có thể thu được dữ liệu thực nghiệm có ý nghĩa về mặt khoa học và có độ tái lặp (reproducibility).

Định nghĩa dPCR

Digital PCR (dPCR) cũng bắt đầu với master mix như phương pháp qPCR (PCR định lượng), cùng với mồi và khuôn ADN. Theo George Karlin Neumann, giám đốc bộ phận khoa học tại trung tâm sinh học kỹ thuật số, công ty sản xuất thiết bị và chẩn đoán y khoa Bio-Rad, “bạn chỉ cần chia master mix thành rất nhiều phần nhỏ, có thể tích bằng nhau (partition)”. Mỗi phần nhỏ này sau đó trở thành một phản ứng độc lập, có hoặc không có tín hiệu huỳnh quang sau khi trải qua các chu kỳ nhiệt, phụ thuộc vào phản ứng có chứa trình tự đích hay không, do đó thuật ngữ digital ra đời.

Nguồn ảnh: https://www.thermofisher.com/

Tính tỷ lệ giữa số phần nhỏ (partition) cho kết quả dương tính và âm tính –  sau đó số liệu này được xử lý theo phương pháp thống kê Poisson để xác định nồng độ đích trong dung dịch ban đầu. Kết quả này được xem như tuyệt đối vì không cần dựng đường cong chuẩn Ct (standard Ct curve) như kỹ thuật qPCR.

Trong các hệ thống dPCR hiện có trên thị trường, thiết bị của công ty công nghệ RainDance và công ty Bio-Rad sẽ phân chia dung dịch phản ứng thành các giọt dầu nhỏ, phương pháp này được gọi là PCR kỹ thuật số dạng giọt (droplet digital PCR – ddPCR) hoặc dPCR nhũ tương (emulsion dPCR), trong khi thiết bị của công ty Fluidigm và Life Technology lại phân chia dung dịch phản ứng vào các lỗ nhỏ hay các giếng có sẵn trên bề mặt vi chíp (chip dPCR).

Ứng dụng của dPCR

Mặc dù cả qPCR và dPCR đều là phương pháp định lượng, nhưng trong một số ứng dụng, phương pháp dPCR lại có ưu thế vượt trội hơn so với qPCR. Trước hết phải kể đến dPCR có thể phát hiện trình tự đích với hàm lượng ít, theo Huggett đây là vấn đề về “độ đặc hiệu” của phương pháp. Ngoài ra, một vấn đề thường gặp với phương pháp dựa vào qPCR là mồi và đầu dò đôi khi có thể gắn vào cả trình tự hoang dại và trình tự đích, do đó không phát hiện các trình tự đích ở hàm lượng dưới 5%. Trong khi đó, “dPCR thường giảm tín hiệu nền từ dạng hoang dại bằng cách pha loãng tất cả ADN, do đó tỷ lệ giữa dạng hoang dại và đột biến thấp hơn nhiều dẫn đến tăng cơ hội phát hiện các đột biến có trong mẫu”.

Dựa vào ưu điểm dPCR có thể phát hiện trình tự đích với nồng độ thấp, các nhà nghiên cứu đã ứng dụng kỹ thuật này trong tầm soát thai nhi nhằm phát hiện các bất thường của bào thai trước khi sinh hay phát hiện các đột biến trong các bệnh ung thư, kiểm soát thải loại cơ quan cấy ghép, theo dõi virus và các ứng dụng khác đòi hỏi khả năng định lượng ADN với độ nhạy cao trong tình trạng mẫu có sự hiện diện của nhiều trình tự khác.

Theo Russell, quản lý sản phẩm của công ty Life Technologies, độ nhạy của dPCR cũng cho phép phát hiện sự khác biệt rất nhỏ trong số bản sao của gen (giữa 7 với 8 bản sao, hoặc thậm chí giữa 10 và 11), sự thay đổi này không thể được phát hiện khi dùng qPCR.

Là nhà định lượng acid nucleic, Huggett có lẽ là người phấn khởi nhất về sự thật rằng với dPCR, “có khả năng bạn và tôi có thể định lượng cùng một mẫu-tôi ở Luân Đôn và bạn ở Minneapolis- và chúng ta có thể cho kết quả có độ tương đồng rất cao mà không cần lo lắng về đường cong chuẩn”, ông nói, “có rất nhiều nghiên cứu định lượng theo thời gian cho thấy bạn có thể thu được các kết quả định lượng rất khác nhau chỉ vì phương pháp dựng đường chuẩn bạn đang sử dụng”.

Nếu bạn cần định lượng chính xác, độ lặp lại và độ nhạy cao từ các mẫu có nồng độ thấp, dPCR là lựa chọn tốt để tiến hành quá trình định lượng. Tất nhiên, không thể có mọi thứ chỉ trong một thiết bị duy nhất, do đó bạn sẽ phải cân nhắc giữa các yếu tố như tốc độ, lượng mẫu nạp vào phản ứng, độ nhạy, khả năng định lượng theo thời gian, hóa chất phụ trợ, chi phí ban đầu và chi phí thực hiện phản ứng cũng như một loạt các nhân tố khác để đưa ra quyết định nên chọn tiêu chí nào phù hợp với mục tiêu của bạn nhất.

Dịch và tổng hợp từ Biocompare

BioMedia VN