Hotline 247
04 6662 6362
 
Hà Nội
0968 378 899
 
Hồ Chí Minh
01289 777 888

CRISPR/Cas9 và chỉnh sửa hệ gen đích: mở ra một giai đoạn mới trong sinh học phân tử

BioMedia

Sự phát triển của các phương thức hiệu quả và tin cậy nhằm tạo ra những thay đổi chính xác với hệ gen của các tế bào sống là một thành công lớn đối với các nhà nghiên cứu về y dược học. Gần đây, một công cụ mới dựa trên Cas9 (Protein 9 có hoạt tính nuclease liên quan đến CRISPR của vi khuẩn) có nguồn gốc từ Streptococcus pyogenes đã tạo nên sự phấn khích đáng kể . Công cụ là một nỗ lực nhiều năm để điều chỉnh chức năng gen, trong đó có tái tổ hợp tương đồng và ARN can thiệp (ARNi). Cụ thể, ARNi đã trở thành một công cụ cơ bản trong phòng thí nghiệm, cho phép can thiệp chức năng gen mà ít tốn kinh phí và có thể thực hiện được với lượng mẫu lớn để sàng lọc. Tuy nhiên một trở ngại của kĩ thuật này là chỉ gây ức chế chức năng tạm thời của gen và hiệu quả không dự đoán được. Các phương án gần đây nhằm gây biến đổi gen đích như: zinc-finger nuclease [ZFNs và nhân tố nuclease dạng hoạt hóa phiên mã [TALENs] đã cho phép các nhà nghiên cứu tạo nên các đột biến bền vững thông qua việc phá vỡ cấu trúc mạch đôi và hoạt hóa các con đường tín hiệu để sửa chữa. Các phương pháp này tốn kém và cần nhiều thời gian, do đó chúng không được sử dụng rộng rãi, đặc biệt cho các nghiên cứu lớn hoặc mang tính chất sàng lọc.

Cơ chế sinh học của Cas9

Chức năng của CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) và các gen liên quan tới CRISPR (Cas) là rất cần thiết cho miễn dịch thụ động trong quá trình sàng lọc vi khuẩn và vi khuẩn cổ, cho phép sinh vật đáp ứng và loại bỏ sự xâm lấn của các vật liệu di truyền lạ. Cụm lặp lại này được phát hiện lần đầu tiên vào những năm 1980 trong vi khuẩn E.coli, tuy nhiên tới năm 2007 thì chức năng của chúng mới được xác định bởi Barangou và các cộng sự. Họ đã chứng minh rằng S. thermophilus có khả năng miễn dịch với thực khuẩn thể bằng cách cài đoạn gen của virus lây nhiễm vào locut CRISPR của vi khuẩn này.

Ba cơ chế của CRISPR đã được phát hiện, trong đó dạng II là dạng đã được nghiên cứu nhiều nhất. Cụ thể, ADN của virus hoặc plasmid bị cắt thành nhiều mảnh nhỏ và cài vào locut CRISPR, nằm giữa các đoạn lặp lại ngắn (khoảng 20bp). Locut này sau đó được phiên mã, các bản phiên mã sau đó được chế biến và tạo nên các ARN nhỏ (crRNA-CRISPR-RNA), ARN nhỏ đóng vai trò dẫn đường cho các nhân tố endonuclease tới đoạn ADN đích (ADN lạ) thông qua đoạn trình tự bổ sung.

Protein Cas9 (còn được biết đến là Csn1) đã được chứng minh là có vai trò quan trọng trong một số cơ chế CRISPR nhất định (đặc biệt là hệ thống CRISPR II), thông qua các thí nghiệm bất hoạt gen và sửa chữa. Cơ chế CRISPR loại II là khác biệt so với các hệ thống CRISPR khác, bởi vì chỉ có một protein Cas (Cas9) là cần thiết để làm tắt gen. Trong hệ thống loại II này, Cas9 tham gia vào quá trình chế biến crRNA, đồng thời chịu trách nhiệm cho sự phá hủy ADN đích. Chức năng của Cas9 trong cả hai quá trình này phụ thuộc vào hai vùng nuclease: vùng nuclease loại RuvC nằm ở đầu amino và vùng nuclease loại HNH nằm ở vùng giữa của protein.

Để có thể nhận biết và cắt đặc hiệu một trình tự ADN, Cas9 cần phải tạo phức hợp với một crRNA và một trans-crRNA hoạt hóa (còn gọi là tracrRNA hoặc trRNA), có một phần trình tự bổ sung với crRNA. Phức hợp này phân cắt đoạn ADN ngoại lai mang 20 nucleotide có trình tự bổ sung với crRNA và nằm gần trình tự PAM. PAM là một trình tự bảo thủ ngắn: 2-5 nucleotide nằm ngay sau đầu 3’ của crRNA. Trên thực tế, phức hệ Cas9-RNA sẽ bỏ qua các trình tự bổ sung nếu như không có sự xuất hiện của trình tự PAM. Trong quá trình phá hủy ADN đích, các vùng nuclease loại HNH và Ruv-C cắt cả hai mạch DNA, tạo nên đứt gãy mạch đôi (DSBs) tại vị trí được xác định bởi 20 nucleotide đích trong bản phiên mã crRNA. Vùng HNH cắt mạch bổ sung, trong khi đó vùng RuvC cắt mạch không bổ sung.

xxclt_ibcGetAttachment

Nguồn ảnh: http://www.clontech.com/

 

Cas9 và CRISPR – một công cụ mới trong sinh học phân tử

Cơ chế hoạt động của CRISPR loại II khá đơn giản: chỉ cần 3 thành phần là Cas9 kết hợp với crRNA và trRNA, điều này khiến cho hệ thống này trở nên thích hợp đối với mục đích sửa chữa hệ gen. Khả năng tuyệt vời này được phát hiện vào năm 2012 bởi phòng thí nghiệm của Doudna và Charphentier. Dựa vào cơ chế của CRISPR II, các tác giả đã phát triển thành một hệ thống đơn giản hơn bằng cách kết hợp trRNA và crRNA thành một RNA dẫn đường dạng tổng hợp (sgRNA). Cas9 được điều tiết bởi sgRNA đã cho thấy có hiệu quả tương tự như khi Cas9 được điều tiết bởi trRNA và crRNA trong quá trình dẫn đường tới làm thay đổi đoạn gen đích.

Cho tới nay, 3 biến thể của Cas9 nuclease đã được sử dụng trong các quy trình làm biến đổi hệ gen. Loại đầu tiên là Cas9 kiểu dại, có khả năng cắt đặc hiệu vị trí một đoạn ADN mạch đôi, từ đó hoạt hóa bộ máy sửa chữa các đứt gãy dạng mạch đôi (DSB). DSB có thể được sửa chữa thông qua con đường nối các điểm cuối không tương đồng (Non-Homologous End Joining-NHEJ), tạo nên các đoạn thêm hoặc mất (indels) và từ đó phá vỡ locut gen đích. Một cách khác, nếu như cung cấp một đoạn ADN có trình tự tương đồng với locut gen đích thì DSB có thể được sửa chữa bằng con đường sửa chữa tương đồng trực tiếp (homology-directed repair-HDR). Phương pháp này cho phép tạo nên các đột biến một cách chính xác.

Cong và cs.  đã đem tới một bước tiến xa hơn cho hệ thống Cas9, tăng độ chính xác bằng cách phát triển dạng đột biến. Phương pháp này được biết đến là Cas9D10A chỉ có hoạt tính gây đứt mạch đơn, do đó không kích hoạt cơ chế NHEJ. Thay vào đó, khi được cung cấp với một khuôn có trình tự tương đồng, ADN được sửa chữa thông qua duy nhất một con đường HDR và nhờ đó các đột biết dạng thêm hay mất sẽ giảm hẳn. Cas9D10A dường như còn hấp dẫn hơn bởi tính đặc hiệu: các locut gen được xác định bởi phức hệ cặp Cas9-được thiết kế để tạo ra đoạn ADN đơn đứt liền kề nhau.

Các đột biến H840A ở vùng HNH và D10A ở vùng RuvC làm bất hoạt hoạt tính cắt, tuy nhiên lại không cản trở khả năng bám vào đoạn ADN. Do vậy, biến thể dạng này có thể được sử dụng với mục đích xác định trình tự đặc hiệu ở bất kỳ vùng nào của hệ gen mà không gây ra cắt xén vùng gen đó. Thay vào đó, dCas9 khi kết hợp với các vùng ảnh hưởng khác nhau sẽ có thể được sử dụng như một công cụ làm tắt gen hoặc hoạt hóa gen. Hơn thế nữa, đây có thể được sử dụng như một công cụ làm hiển thị. Ví dụ, Chen và cs. đã sử dụng Cas9 kết hợp với protein phát huỳnh quang màu xanh tăng cường (EGFP) để hiển thị các vùng ADN lặp lại với một sgRNA đơn lẻ hoặc các locut không lặp với một số agRNA.

Hiệu quả đích, hay nói cách khác là tỉ lệ tạo được đột biến mong muốn là một trong những yếu tố quan trọng hàng đầu để đánh giá một công cụ gây biến đổi hệ gen. So với các phương pháp đã được xây dựng như: TALENs hay ZFNs, hệ thống Cas9 có thể nói là có nhiều thuận lợi hơn. Ví dụ, ở các tế bào người, ZFNs và TALENs chỉ có thể đạt hiệu quả từ 1%-50%. Ngược lại, hệ thống Cas9 đã được báo cáo là đạt hiệu quả lớn hơn 70% ở cá ngựa vằn và thực vật, đạt hiệu quả từ 2-5% ở các tế bào gốc đa tiềm năng được kích hoạt. Hơn nữa, Zhou và đồng nghiệp đã có thể tăng hiệu quả biến đổi gen đích lên đến 78% ở tế bào phôi chuột, đồng thời việc truyền lại tế bào mầm đạt hiệu quả thông qua sử dụng hai sgRNA để cùng lúc nhắm vào một gen.

Một phương pháp đã được sử dụng rộng rãi để xác định các đột biến là thí nghiệm xác định đột biến T7 Endonulease I. Thí nghiệm này xác định đoạn ADN mạch đôi được tạo nên từ sự gắn kết của một mạch ADN mang đột biến mong muốn với một mạch ADN kiểu dại. ADN hệ gen được khuếch đại với các mồi bao quát các locut bị biến đổi. Sản phẩm PCR sau đó được biến tính và gắn kết lại, tạo nên 3 loại cấu trúc. Các cấu trúc kép không đối xứng được cắt bởi T7 Endonuclease I. ADN sau đó được điện di riêng rẽ và phân tích đoạn được sử dụng để tính toán xác định hiệu quả tác động tới gen đích.

Một yếu tố quan trọng nữa là tỉ lệ của các đột biến ở những vị trí không phải là đích, những vị trí này chỉ sai khác một vài nucleotide so với trình tự gốc và nằm liền kề với trình tự PAM. Các đột biến loại này thường khó xác định, đòi hỏi phải giải trình tự toàn bộ hệ gen nhằm loại bỏ chúng hoàn toàn. Các tiến bộ gần đây của hệ thống CRISPR nhằm giảm thiểu các đột biến ngoài gen đích đã được hoàn thiện thông qua sử dụng gRNA cắt ngắn hoặc bằng cách thêm hai nucleotide dạng G vào đầu 5’. “Cặp nuclease” cũng là một phương pháp mà các nhà nghiên cứu sử dụng để hạn chế các đột biến không mong muốn. Trong chiến lược này, D10A Cas9 và 2 sgRNA bổ sung với vùng liền kề ở mạch đối diện với vị trí đích. Khi hệ thống này kích hoạt DSB ở đoạn ADN đích thì đồng thời sẽ tạo ra đứt gãy mạch đơn ở vị trí không đặc hiệu, từ đó hạn chế các đột biến ngoài vị trí gen đích.

Bằng những tính toán nhằm giảm thiểu các đột biến không mong muốn, một số nhóm nghiên cứu đã phát triển các công cụ sử dụng website tạo thuận lợi cho quá trình xác định các vị trí có thể là đích tác động của hệ thống CRISPR và đánh giá khả năng cắt các vị trí này của CRISPR. Một số ví dụ về các công cụ này là: CRISPR design Tool và ZiFiTTargeter Version 4.2 .

Các ứng dụng trong tác động và sửa chữa hệ gen đích

Hệ thống CRISPR/Cas9 đã được ứng dụng thành công để tác động đến các gen quan trọng trong nhiều dòng tế bào và sinh vật như: người, vi khuẩn, các ngựa vằn, giun tròn, thực vật,  Xenopustropicalis, nấm men, ruồi giấm, khỉ, thỏ, lợn, chuột. Tận dụng điểm mạnh của phương pháp này, một số nhóm nghiên cứu đã tạo các đột biến điểm (thêm hoặc mất) trong một gen nhất định thông qua gRNA đơn. gRNA đôi có thể được sử dụng để gây mất đoạn lớn hoặc sắp xếp lại hệ gen, ví dụ như làm đảo đoạn hoặc chuyển vị trí. Một phát hiện thú vị gần đây là sử dụng dCas9 để tác động đến vùng protein nhằm điều hòa quá trình phiên mã, biến đổi di truyền ngoại gen  và hiển thị các locut gen mong muốn.

Hệ thống CRISPR/Cas9 chỉ yêu cầu tái thiết kế crRNA nhằm thay đổi tính đặc hiệu khi tác động tới gen đích. Điều này ngược lại với các công cụ sửa chữa hệ gen khác như zinc finger hay TALENs, các công cụ này đòi hỏi sự tái thiết kế lại ADN-protein.

Hệ thống CRISPR/Cas9 trong tương lai

Quá trình phát triển Cas9 thành bộ các công cụ cho nghiên cứu sinh học tế bào và phân tử khá ấn tượng, lí do là vì sự đơn giản, hiệu quả cao và tính linh động của hệ thống này. CRISPR/Cas9 là hệ thống được sử dụng phổ biến nhất trong số các hệ thống phục vụ cho kĩ thuật làm biến đổi hệ gen một cách chính xác. Cho tới nay, các ứng dụng của Cas9 đã vượt xa ngoài khả năng cắt xén ADN và tính hữu dụng của hệ thống này trong việc thu hút protein tới các vị trí đặc hiệu trong hệ gen dường như không còn chỉ là tưởng tượng.

Dịch và tổng hợp từ NEB

BioMedia VN

Các bài viết cùng chủ đề

CRISPR/Cas9 và chỉnh sửa hệ gen đích: mở ra một giai đoạn mới trong sinh học phân tử

Sự phát triển của các phương thức hiệu quả và tin cậy nhằm tạo ra những thay đổi chính xác với hệ gen của các tế bào...

Liệu pháp gen

1. Liệu pháp gen là gì? Liệu pháp gen là liệu pháp đưa acid nucleic vào các tế bào của bệnh nhân như một loại...

Khai thác dữ liệu gen ung thư

Nguồn ảnh: http://www.sinoglobalcapital.com/ Giải trình tự gen thế hệ mới (Next – generation sequencing – NGS) cùng với các kỹ thuật sinh học phân tử khác...